A múzeum alapításának hagyományosan elfogadott éve 1709, ekkor hozta haza a hollandiai Leydenből Simándi István professzor azokat a korszerű fizikai szemléltető eszközöket, amelyeket ritkaságuk és látványosságuk miatt Museum Physicum néven őrzött a kollégium.

A későbbiekben kialakult a Természetrajzi Gyűjtemény, majd a Szépészeti Gyűjtemény is. A többszöri szervezeti átalakulás után a múzeum egy része a gimnáziumban, a másik pedig a Berna-sor épületében kapott helyet. A gyűjtemény 1952-ben kiegészült a Faluszeminárium gazdag néprajzi anyagával. A jelenlegi állománya több mint 25 000 tárgy.

A múzeum dokumentálja a Református Kollégium történetét 1952-ig, az államosításig. Az oktatás és nevelés históriáját, valamint a diákélet hétköznapjait és ünnepeit reprezentáló tárgyak mellett emléket állít a kiállítás Comenius Amos Jánosnak (Jan Amos Comensky) a kiváló cseh pedagógusnak is (1592–1670), aki 1650-től négy évig tanított a sárospataki kollégiumban. Itt írta meg könyvét a szemléltető oktatásról Orbis sensualium pictus (A látható világ képekben) címmel.

Bemutatják a református egyházművészet legjelesebb, az északkelet-magyarországi népi díszítő művészetet tükröző tárgyakat is.

Cím: Rákóczi u. 1.